باعث افزایش تغییرات کروموزومی و تجمع این تغییرات در سلول نشده است .(Ashwood et al., 1979)
فرایند سرد کردن آهسته با بهره گرفتن از مواد محافظ انجمادی با غلظت کمی در حدودmol/l 2-1 و سرعت سرمای پایین(۰/۱-۱°c/min) انجام می گیرد. در طی این فرایند سلول در طی چند مرحله آبگیری[۴۸] شده و سپس نمونه با کمک دستگاه فریزر[۴۹]
در-۷°c با سرعت ۱-۲°c/min به آرامی به مدت ۱۰ تا ۱۵ دقیقه سرد می شود. در مرحله بعد نمونه با سرعت ۰/۳°c/min در دمای -۳۰°c سرد شده و سپس در نیتروژن مایع ذخیره می شود. لازم به ذکر است که میزان سرد کردن سلول با توجه به اندازه و نفوذ پذیری سلول تعیین می شود که با کمک دستگاه فریزر برنامه ریزی و تنظیم می شود(Shaw et al., 2003; Jain et al., 2006). میزان سرمایی که به منظور سرد کردن آهسته تخمک ها و جنین ها استفاده می شود ۰/۳°c/min تا ۱ می باشد که بر اساس اندازه و میزان نفوذ پذیری آنها به مواد محافظ انجمادی، پایین تر از سلولهای سوماتیک[۵۰]،اسپرم یا اریترو سیت[۵۱] ها می باشد (<100°c/minتا(۱ (Shaw et al., 2003).
موفقیت در انجماد آهسته بستگی به دستیابی به بهترین تعادل بین میزان خروج آب از سلول و تبدیل آن به یخ در خارج از سلول دارد. تعادل توسط غلظت پایین مواد محافظ انجمادی و میزان سرمای آهسته قابل دستیابی است و اجازه می دهد که آبگیری در طول سرد شدن اتفاق بیافتد (Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005).
علیرغم استفاده از فرایندهای انجماد آهسته به منظور حفاظت انجمادی جنین ها و تخمک های انسانی، تخمک ها و جنین های گونه های اهلی مانند خوک و گاو حساسیت سرمایی بسیار بیشتر و بازدهی کمتری نسبت به تخمک ها و جنین های انسانی دارا می باشند (Shaw et al., 2003). از طرف دیگر نگهداری تخمک ها و جنین های انسانی تحت سرما از ۹۰ دقیقه تا ۵ ساعت طول می کشد که این میزان سرمای آهسته باعث ایجاد تعادل بین فاکتورها می شود ولی باعث تشکیل کریستالهای یخ، شوک اسمزی[۵۲]، آسیب های سرمایی مانند شکسته شدن غشای شفاف[۵۳]، بلاستومر[۵۴]هاو تغییرات اسکلت سلولی نیز می شود (Orief et al., 2005). به علت معایب و آسیب های ناشی از انجماد آهسته، راهکاری در جهت کاهش زمان فرایند حفاظت انجمادی، حذف تجهیزات گران قیمت و کاهش تشکیل کریستالهای یخ به منظور حفظ و ذخیره تخمک و جنین گونه های مختلف اتخاذ شده است که این فرایند انجماد شیشه ای نامیده می شود (Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005).
۱-۸- انجماد شیشه ای
انجماد شیشه ای یک روش جدیدی است که در آن از تشکیل یخ خارج سلولی و داخل سلولی جلوگیری می شود و یک وضعیت شبیه به شیشه ایجاد می شود. انجماد شیشه ای تکنولوژی ساده، سریع و ارزانتر از روش انجماد آهسته می باشد (Varghese et al., 2009) که از سال ۱۹۷۰ تا کنون در جهت حفاظت انجمادی مواد بیولوژیک به کار گرفته شده است (Shaw et al., 2003). در دماهای پایین محلولها بسیار غلیظ می شوند و یک حالت جامد بدون اینکه بلور یخ تشکیل شود ایجاد می شود این حالت در اثر دهیدراسیون و افزایش بسیار زیاد در غلظت رخ می دهد که سرعت های بسیار زیاد انجماد از ºC/min 30000-15000 عامل آن است (Liebermann et al., 2003).
وضعیت انتقال شیشه ای (Glass transition) در دمای حدود ۱۳۰- درجه سانتی گراد رخ می دهد.(Kasai & Mukaida, 2004) ولی می تواند این دما با توجه به اجزای محلول انجماد شیشه ای متغییر باشد.
انجماد شیشه ای محلولها از زمان ۱۹۴۸ انجام شده است (Kauzmann, 1948) ولی اولین بار نگهداری رویان موش در ۱۹۸۵ میلادی انجام گرفت (Rall & Fahy, 1985). یک سال بعد اولین رویان گاو که بطور موفق بطور شیشه ای منجمد شد گزارش شد (Massip et al., 1986). پیشرفتهایی در زمینه انجماد شیشه ای از تاریخ استفاده از مواد شیمیایی با سمیت پایین و قابلیت نفوذ بیشتر و نیز استفاده از ترکیب ضد یخ ها برای کاهش سمیت و استفاده از روش مرحله ای[۵۵] برای تعادل و نیز افزایش سرعت انجماد و ذوب صورت گرفته است (Vajta & Kuwayama, 2006).
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
Fahy در سال ۱۹۸۴ در مقاله ای با توصیف انجماد شیشه ای و عوامل موثر در آن پیشنهاد کرد که این روش بتواند برای نگهداری سلولها و اعضاء بکار گرفته شود. وی می گوید، به کمک انجماد شیشه ای در جریان انجماد جنبش ملکولها متوقف شده و ساعت بیولوژیک از کار می افتد در حالی که آندسته از تغییراتی که در جریان انجماد کند در سلولها رخ می دهد پیش نمی آید. Rall و Fahy برای انجماد جنین ۸ سلولی موش از روش انجماد شیشه ای استفاده کردند. آزمایشات Rall نشان داد در صورتی که مقدار مواد ضد یخ در محیط افزایش یابد(<40% حجم محلول) آب داخل و خارج سلول در جریان انجماد به بلورهای یخ تبدیل نمی شوند بلکه در عوض بدون افزایش حجم به مادهای غلیظ و سرد تبدیل می شوند و در نتیجه به سلول آسیب نمی رسانند. همین محقق با همکارانش در سال ۱۹۸۷ در مقاله ای اصول حاکم بر انجماد شیشه ای را بررسی کرد و با مرور مطالعات گذشته اظهار کرد که از این روش می توان در انجماد سلولها و برخی از بافتها استفاده کرد. در حقیقت در این روش با جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ متعاقب افزایش غلظت مواد موجود در جنین و محلولی که جنین در آن قرار گرفته از بروز صدمات وارده به دنبال تشکیل بلورهای یخ جلوگیری می شود.
بدین منظور راههایی برای نیل به این هدف اندیشیده شده است:
افزایش سرعت انجماد، بطوری که محلول حاوی جنین فرصت کافی برای تشکیل و بزرگ شدن بلورهای یخ نداشته باشد. محاسبات نشان داده که حتی آب خالص در صورتی که در سرعت ۱۰ میلیون درجه در دقیقه سرد شود بجای تشکیل بلور به مواد شبه شیشه تبدیل خواهد شد.
افزودن مقدار کافی ماده ضد یخ ابزار مفیدی است که به کمک آن می توان تشکیل بلورهای یخ را تحت کنترل در آورد. افزودن ضد یخ باعث کاهش نقطه انجماد، افزایش غلظت در دماهای زیر صفر و کاهش نسبی فشار اسمزی محلول می شود. بالا بردن فشار هیدراستاتیک در جریان انجماد نیز باعث کاهش نقطه انجماد شده و مشابه ضد یخ عمل می کند.
تقسیم محلول حاوی جنین به ذرات و قطرات کوچکتر بطوری که به مایع موجود اجازه تشکیل بلور یخ داده نشود.
مقدار محلول، ظرفیت لوله یا نی انجماد و نوع ضد یخ از عواملی هستند که در تعیین میزان ضد یخ و سرعت انجماد نقش دارند. اگر نمونه کوچک باشد و ضخامت نی کم باشد می توان آن را با سرعت زیاد سرد کرد و داخل نیتروژن مایع قرار داد لیکن اگر نمونه بزرگ باشد (مانند بافتهای جانوری) بایستی محلول را با سرعت کم سرد کرد و از غلظتهای مناسب ضد یخ برای انجماد استفاده کرد.
در آن زمان تصور می شد که برای یک انجماد شیشه ای موفق حتما بایستی عوامل زیر استفاده شوند:
یک ماده ضد یخ با وزن ملکولی پایین که براحتی و به سرعت بتواند وارد جنین شود مانند DMSO غلظت چنین ضد یخی نیز باید بالا باشد
استفاده از مادهای مانند استامید که با تکیه بر قابلیت برخی از آمیدها در کاهش سمیت موادی مانند DMSO برای کم کردن سمیت ضد یخ بکار می رفت.
استفاده از ترکیب یونی به منظور بر قرار کردن خاصیت ایزوتونیک محلول و متناسب کردن فشارهای اسمزی درون و بیرون سلولی
استفاده از موادی مانند پلی اتیلن گلیکول یا پلی ونیل پیرولیدون (PVP) که به علت وزن ملکولی بالا نمی توانند به داخل سلول نفوذ کنند و دارای خواص ضد انجمادی بوده و با پایین آوردن نقطه انجماد به عنوان یک ضد یخ نفوذ ناپذیر بکار گرفته می شود. ولی تحقیقات بعدی توسط Massip و همکارانش ضمن معرفی محلول جدیدی برای روش انجماد شیشه ای نشان داد که حضور تمام مواد پیشنهاد شده توسط Rall برای انجماد شیشه ای ضرورت ندارد، محلول ضد یخی که Massip و همکارانش استفاده کردند مخلوطی از ۴/۳ مول گلیسرول، ۴/۳ مول پروپیلن گلیکول بود به علاوه از ماده ای مانند استامید استفاده نشده بود و غلظت ضد یخ نفوذ ناپذیر (ماکروملکول) نیز در آن بشدت کاهش یافته بود (حدود ۳/۰ درصد) وی گزارش کرد که این محلول برای حفاظت جنین گاو و موش در مرحله مورولا و بلاستوسیست قابلیت خوبی داشته است. هر چند که این محلول برای نگهداری بلاستوسیست ها به خوبی مورولا نبوده است (Massip et al., 1986).
Valdez با بکار گیری همان ضد یخ هایی که Massip استفاده کرده بود تاثیر زمان تعادل، درجه حرارت محیط قبل از انجماد و مرحله رشد[۵۶] را در موفقیت روش انجماد شیشه ای بررسی کرد. وی جنین های مرحله ۸ سلولی، مورولا و بلاستوسیست را به مدت ۵، ۱۰، ۱۵ و ۲۰ دقیقه در دو محلول ضد یخ قرار داد. یکی از محلولها قبلا تا دمای ۴ درجه سانتی گراد سرد شده بود و دیگری در حرارت آزمایشگاه قرار داشت پس از آن جنین ها را با نی های مخصوص انجماد منتقل و وارد نیتروژن مایع کرد جنین های منجمد پس از ۱ تا ۶۴ روز از نیتروژن خارج و با سرعت زیاد ذوب شدند. جنین های زنده پس از شستشو در محلول فسفات بافر به قطرات محیط کشت منتقل شدند.
نتایج از مطالعات وی نشان داد که:
مناسب ترین زمان تعادل بسته به مرحله جنین فرق می کند بطوری که برای جنین های ۸ سلولی و بلاستوسیست ۱۰ دقیقه و برای مورولا ۵ الی ۲۰ دقیقه بود.
دمای ضد یخ در مرحله تعادل بر درصد زنده ماندن و رشد جنین ها تاثیر دارد. جنین هایی که در محلول ضد یخ ۴ درجه سانتی گراد قرار گرفته بودند رشد بهتری نسبت به آنهایی که در دمای ۲۰ درجه سانتی گراد قرار داشتند نشان می دادند.
مرحله رشد جنین در موفقیت انجماد شیشه ای تاثیر دارد بطوریکه جنین های مرحله مورولا، ۸ سلولی و بلاستوسیست به ترتیب بیشترین مقدار رشد را نشان می دادند.
در یک جمع بندی از نظریات مختلف محققین که روش انجماد شیشه ای را برای منجمد کردن جنین بکار بردهاند می توان گفت:
انجماد شیشه ای بدلیل جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ در زمان انجماد و ذوب مانع از آسیب رسانیدن بلورهای یخ به جنین می شود و با پیشرفت تحقیقات کاربردهای زیادی پیدا می کند. فرایند انجماد شیشه ای با بهره گرفتن از غلظت های بالای مواد محافظ انجمادی (۵-۷ M) و سرعت سرمای بسیار بالا (۲۰۰۰۰-۲۰۰۰۰۰°c/min) باعث جامد شدن محلولها به شکلی شبیه شیشه (فاقد ساختار کریستالی) می شود (Shaw et al., 2003; Varghese et al., 2009). تا کنون این روش در بسیاری از حیوانات آزمایشگاهی و اهلی بکار گرفته شده و نتایج قابل قبولی بدست آمده است.
زمان تعادل محیط ضد یخ و جنین اهمیت فراوانی دارد و کنترل آن برای یک انجماد موفق لازم است. افزایش زمان تعادل باعث بروز مسمومیت در جنین می شود. وزن ملکولی ضد یخ و سرعت ورود آن به جنین نیز در انتخاب زمان تعادل مناسب تاثیر می گذارد. هر چند که بنظر می رسد هر چه میزان ضد یخ در جنین بالاتر رود امکان یخ زدن داخل جنین کاهش می یابد اما باید در نظر داشت که به علت سمیت ضد یخ ها افزایش غلظت ضد یخ درون سلول به آن آسیب می رساند. برای مقابله با این مشکل برخی از محققین پیشنهاد کرده اند که ضد یخ را در چند مرحله وارد محیط کنند و بتدریج غلظت را افزایش دهند. بدین ترتیب ضمن افزایش غلظت ضد یخ در جنین از اثرات ناشی از افزایش فشار اسمزی جلوگیری می شود. به هر حال تحقیقات نشان داده که در اکثر گونه های حیوانات زمان تعادل مناسب بین ۵/۰ تا ۲ دقیقه است.
حرارت محیط تعادل نیز در موفقیت انجماد شیشه ای اهمیت دارد. با توجه به اینکه هر چه حرارت محیط بیشتر باشد نفوذ ضد یخ به داخل سلول سرعت بیشتری می گیرد و از طرفی به علت افزایش متابولیسم سلول احتمال تخریب سلولی متعاقب ورود مقادیر زیاد ضد یخ نیز افزایش می یابد، عده ای از محققین به این نتیجه رسیده اند که بهتر است ضد یخ را در دمای ۴ درجه سانتی گراد وارد سلول کنند و یا در صورتی که ضد یخ را در چند مرحله وارد سلول می کنند مراحل نهایی را در دمای ۴ درجه سانتی گراد انجام می دهند. هر چند که عده ای از محققین توانسته اند در دمای ۲۰ درجه سانتی گراد نیز نتایج بسیار خوبی بدست آورند. به هر حال باید در نظر داشت که نوع و غلظت ماده ضد یخ در انتخاب دمای تعادل اهمیت ویژه ای دارد.
بر خلاف آنکه ابتدا تصور می شد برای انجماد شیشه ای بایستی از مواد ضد یخی استفاده کرد تحقیقات بعدی نشان داد که استفاده از دو ضد یخ به طور همزمان و حتی یک نوع ضد یخ می تواند کاربرد داشته باشد. نکته ای که حائز اهمیت است استفاده از ضد یخ در غلظت بالا است بطوری که مقدار ضد یخ در محلول بایستی بیش از ۴۰ درصد باشد. با توجه به خواص مختلف و سمیت متفاوت ضد یخ ها به هر حال بایستی غلظت ضد یخ را طوری انتخاب کرد که در عین بالا بودن غلظت که احتمال تشکیل بلور یخ را کاهش می دهد سمیت آن به جنین لطمه نزند. مطالعات نشان داده که در بسیاری از موارد مخلوطی از DMSO و اتیلن گلایکول می تواند به عنوان ضد یخ مناسب استفاده شود لیکن گونه حیوان و مرحله رشد جنین نیز در استفاده از ضد یخ در نظر گرفته می شود. استفاده از موادی مانند گلیسرول و پروپاندیول که از سمیت کمتری برخوردار هستند نیز اجازه می دهد تا غلظت بیشتری از ضد یخ را برای انجماد استفاده کنیم هر چند که اثرات غیر مستقیم چنین موادی ممکن است به سلول لطمه بزند.
سرعت انجماد نیز در انجماد شیشه ای عامل مهمی است. هر چند که غلظت بالای ضد یخ در فرایند شیشه ای از یخ زدن آب موجود جلوگیری می کند ولی در صورتی که سرعت انجماد خیلی پایین باشد به آب درون سلولی اجازه یخ زدن و گسترش بلورهای یخ را می دهد که می تواند به سلول صدمه بزد. سرد کردن معمولا در یک مرحله و بطور مستقیم از دمای ۰°C < به دمای زیر صفر-۱۳۰°C ≤ در نیتروژن مایع صورت می گیرد(Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005; Varghese et al., 2009). بنابراین در این روش باید برخلاف انجماد آهسته از سرعتهای انجماد بالاتر استفاده کرد. به نظر می رسد برای انجماد شیشه ای از سرعتهای حدود ۱۵ تا ۲۵۰۰ درجه در دقیقه می توان بهره جست. هر چند که در تحقیقات اخیر عمدتا نی های حاوی جنین از دمای ۴ یا ۲۰ درجه سانتی گراد مستقیما به تانک نیتروژن مایع منتقل شده اند (۲۵۰۰ ~ درجه سانتی گراد). با توجه به سرعت زیاد سرد شدن محلول حتی در صورتی که ذرات آب درون سلول یخ بزند اندازه آنها آنقدر کوچک خواهد بود که به سلول لطمه نمی زند. این نکته را نیز باید در نظر گرفت که جنس نی یا لوله ای که برای انجماد جنین استفاده می شود نیز اهمیت دارد. لوله های شیشه ای بدلیل عدم قابلیت انقباض و انبساط در جریان یخ زدن و ذوب شدن می توانند باعث افزایش فشار درون لوله شده و بدنبال آن ترکهایی در محتویات لوله ایجاد شود. به علاوه لوله های شیشه ای و برخی لوله های پلاستیکی در حین ذوب شدن ممکن است بترکند و محتویات لوله بیرون بریزد و در حال حاضر لوله هایی از جنس پلی پروپیلن ساخته شده که تا حد زیادی این مشکلات را مرتفع می سازد. با توجه به اینکه در جریان انجماد شیشه ای بلورهای یخ تشکیل نمی شوند در نتیجه اگر لوله حاوی ضد یخ و جنین در حین انجماد و یا ذوب کدر شود (بدلیل تشکیل بلور یخ) علامت خوبی است که محتویات آن لوله به احتمال قوی یخ زده و جنین ها صدمه دیده اند. البته باید در نظر داشت که مشاهده چنین وضعیتی بطور قطعی دلیل بر مرگ جنین ها نیست و مشاهده مستقیم زیر میکروسکوپ باید آنرا تایید کند(Rall et al., 1987).
سرعت ذوب تاثیر عمیقی بر زنده ماندن و رشد جنین دارد. در جریان انجماد شیشه ای به هر حال ذرات بسیار کوچک یخ درون سلول تشکیل می شود(Macfarlane, 1986). بطور معمول قطر ذرات یخی که در جریان انجماد شیشه ای درون سلول ایجاد می شود آنقدر کوچک است که حتی با روش تفرق اشعه X قابل تشخیص نیستند.(Dupuy et al., 1982) اما همین ذرات ریز یخ در جریان ذوب می توانند در صورتی که فرصت کافی داشته باشند به یکدیگر بپیوندند و بلورهای یخ درشت تری تشکیل دهند و به سلول صدمه برسانند. مقدار یخی که در جریان ذوب ممکن است تشکیل شود به مقدار و نوع ضد یخ و سرعت ذوب بستگی دارد. افزایش سرعت ذوب به این ترتیب به ذرات ریز یخ اجازه رشد نمی دهد و قبل از اینکه ذرات یخ رشد کنند مولکولهای شیشه ای شده به مایع تبدیل می شوند. تحقیقات نشان داده در مواردی که جنین به روش انجماد شیشه ای منجمد شده باشد اگر سرعت ذوب بالاتر از ۲۰۰ درجه سانتی گراد در دقیقه باشد از تشکیل مجدد بلورهای یخ جلوگیری می شود. البته گزارشات اندکی در دست است که نشان می دهد در مواردی تعدادی از جنین هایی که با سرعت ۱۰ درجه سانتی گراد در دقیقه ذوب شده بودند نیز زنده ماندند. در حال حاضر روش رایج برای ذوب جنین های منجمد شده به روش انجماد شیشه ای قرار دادن نی های حاوی جنین بلافاصله پس از خروج از نیتروژن مایع در بن ماری ۲۰ و یا ۳۷ درجه سانتی گراد است (Luyet et al., 1968).
خارج کردن ضد یخ پس از ذوب از محیط معمولا در یک و یا دو مرحله صورت می گیرد و معمولا از یک ماده نفوذناپذیر مانند سوکروز که فشار اسمزی بالایی نیز ایجاد می کند استفاده می کنند. غلظت سوکروز M 3/0 تا M 1 است. هر چند که استفاده و یا عدم استفاده از سوکروز تاثیر چندانی بر زنده ماندن و رشد جنین های منجمد شده نداشته است، اما به هر حال بدلیل نفوذ مقداری ضد یخ غلیظ بداخل سلول در جریان تعادل و انجماد، منطقی بنظر می رسد که در زمان ذوب این ماده که معمولا سمی نیز هست از جنین خارج شود که این کار با اعمال فشارهای اسمزی توسط سوکروز انجام می پذیرد(Shaw et al., 1995).
۱-۸-۱- ضد یخها ( مواد محافظ در سرما)[۵۷]
ضد یخها در انجماد سلولها نقش اساسی دارند و بدون استفاده از آنها میزان موفقیت در انجماد کم و یا در حد صفر خواهد بود. ضد یخها از طرفی باعث تغییر در فشارهای اسمزی می شوند(Mazur, 1963) و در حقیقت در جریان انجماد از افزایش بی رویه فشار اسمزی خارج سلول جلوگیری می کنند و از سویی جایگزین آب درون سلولی شده و با پیوند با ملکولهای آب از یخ زدن آن جلوگیری می کنند. ضد یخها اصولا به دو دسته تقسیم می شوند:
۱- ضد یخهایی که وزن ملکولی آنها بیش از صد دالتون است و قادر نیستند از غشاء سلولی عبور کنند مانند ساکارز ، رافینوز، پلی وینیل پیرولیدون، PVP و غیره.
۲- ضد یخهایی که وزن ملکولی کمتری دارند و بسته به وزن و شکل فضایی ملکولی با سرعت های متفاوتی از غشاء سلولی عبور می کنند مانند انواع گلیکولها ، DMSO، گلیسرول، برخی از قندها و غیره .
دسته اول را ضد یخ های نفوذ ناپذیر و دسته دوم را ضد یخ های نفوذ پذیر می نامند. ضد یخهای نفوذناپذیر تنها با افزایش غلظت و فشار اسمزی خارج سلولی باعث خروج آب داخل سلولی می شوند. در حالی که دسته دوم علاوه بر خاصیت گفته شده وارد سلول شده و با ملکولهای آب پیوند شده و یا جایگزین آن می شوند(Mazur, 1963) .
۱-۸-۱-۱- ضد یخ های نفوذ ناپذیر
این ضد یخ ها شامل موادی از این قبیل هستند: قندهایی با وزن ملکولی بالا مانند ساکارز، رافینوز، ترهالوز[۵۸]، انواع پروتئین ها که به دلیل وزن ملکولی بالا قادر به عبور از غشاء سلول نیستند مانند پروتئینهای سرم خون از قبیل آلبومین ها، گاما گلبولینها، پروتئینهای موجود در شیر مانند کازئین، پروتئین های زرده تخم مرغ که بیشتر در انجماد اسپرم بکار می روند و مواد مصنوعی مانند PVP، فایکول و PVA. معمولا این مواد در غلظت های پایین و همراه با سایر ضد یخها بکار می روند و باعث افزایش فشار اسمزی محیط خارج سلول می شوند و این ضد یخها به منظور دهیدراتاسیون آب داخل سلولی ضروری می باشند علاوه بر این آنها نقطه انجماد را پایین می آورند. بنابراین فرصت زیادتری برای دهیدراتاسیون ایجاد می کنند. دقت کافی در انتخاب ضد یخها ضروری می باشد علت این امر میزان سمیت و قابلیت نفوذ ضد یخها می باشد. ضد یخها در غلظتهای بالا سمی می باشند ولی سمیت آنها در دماهای پایین به حداقل می رسد و نیز در صورتی که رویان به مدت کوتاهی در معرض ضد یخ قرار گیرد سمیت آن به حداقل می رسد (Agca et al., 1998). علاوه بر این استفاده از مواد محافظ انجمادی نفوذ ناپذیر[۵۹] همراه با مواد محافظ انجمادی نفوذ پذیر[۶۰] باعث افزایش ویسکوزیته محیط و کاهش غلظت الکترولیت ها می شود و از این طریق از استرسهای ناشی از شوک اسمزی جلوگیری می کند (Liebermann et al., 2002; Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005).
۱-۸-۱-۲- ضد یخ های نفوذ پذیر
این ضد یخها مولکول های کوچکی هستند که به آسانی به غشاء سلول نفوذ می کنند، آنها با مولکول های آب باندهای هیدروژنی تشکیل می دهند و از تشکیل کریستال های یخ جلوگیری می کنند، در غلظتهای پائین دمای انجماد محلول را کاهش می دهند و در غلظت های بالا از تشکیل کریستال های یخ جلوگیری می کنند و منجر به تشکیل یک حالت شبیه به شیشه می شوند که حالت شیشه ای نامیده می شود که در آن آب منجمد شده ولی منبسط نشده است. به این طریق مواد محافظ سرمای نفوذ پذیر اولین هدف انجماد موفق را که جلوگیری از تشکیل کریستال یخ می باشد را برآورده می سازند. مواد محافظ سرما نقش ثانویه مهمی را در موفقیت انجماد دارند و آن حفاظت سلول از اثرات مواد محلول می باشد و این هدف به وسیله باقی ماندن در محلول حاصل می شود. بنابراین به طور موثری الکترولیت های باقی مانده را رقیق می کند. اگرچه غلظت بالای مواد محافظ انجمادی باعث کاهش تشکیل کریستالهای یخ می شود ولی این غلظت ها باعث ایجاد اثرات سمی و حتی شوک اسمزی می شود. بنابراین برای کاهش اثرات فوق سه راهکار وجود دارد:
۱-اضافه کردن پلیمرهای نفوذ ناپذیر همراه با مواد محافظ انجمادی نفوذ پذیر
۲-افزایش میزان سرما (Orief et al., 2005)
۳-استفاده از حجم کمی از مواد محافظ انجمادی در هنگام انتقال ماده بیولوژیک به نیتروژن مایع (Fujiwara et al ., 2010).
۱-۸-۲- قندها
ساکاریدهای بکار رفته در انجماد رویان به سه دسته تقسیم می شوند: مونوساکاریدها، دی ساکاریدها و پلی ساکاریدها.
مونوساکاریدها شامل: گلوکز، فروکتوز، سوربیتول و مانیتول می باشند. و دی ساکاریدها شامل ساکارز و ترهالوز می باشند و از جمله پلی ساکاریدها می توان به رافینوز اشاره کرد(Kuleshova et al.,2001;Fair et al., 2001;Dattena et al., 2004;Mavrides 7& Morroll,2005; Campos- Chillon et al., 2006). ساکاریدها در دماهای خنک و سردتر غیر سمی هستند ولی می توانند در دماهای بالا مضر باشند(Kasai & Mukaida, 2004). ترهالوز بعنوان یک دی ساکارید، یک ضد یخ طبیعی بوده که در اسپورهای قارچ، خمیر ترش، کیستهای میگوهای دریایی و بعضی از نماتودها یافت می شود. به نظر می رسد که این ماده از تغییر غشاء سلولی در طی کاهش آب جلوگیری کند البته مکانیسم این عمل تا کنون بخوبی شناخته نشده است. به اختصار قندها دارای چندین اثر سودمند در طی فرایند حفاظت انجمادی می باشند:
۱-باعث ایجاد شیب اسمزی در طول غشای سلولی می شوند
۲-باعث حفاظت غشا از نظر ساختاری و عملکردی در برابر کاهش مقدار کم آب می شوند
