HPLC روشی ساده و سریع برای شناسایی پاراکوات در پلاسما و سرم انسانی با بهره گرفتن از (۱،۱بی پیریدیلیدیوم یا همان دی اتیل پاراکوات) است که به عنوان یک استاندارد داخلی مورد استفاده قرار میگیرد. یک ستونی از اکتادسیل سیلیکا که با یک حجم ۱۰% از استونیتریل که خود شامل سدیم ۱-اکتانوسولفونیک اسید(۳۰ میلی مول) و یک بافر دی اتیل آمین اورتو فسفریک اسید با PH:3 بکار برده میشود. عدم تشابه با دیگر تکنیکها، و همچنین نیاز موجود برای حل مشکل این نمونه مورد نظر تنها با رسوب محتوی پروتئینی با ۶% محلول حجمی پرکلریک اسید در متانول برطرف میشود.کمتری حد تشخیص این متد در یک محدوده خطی از gr/mlµ ۰٫۱ تا gr/mlµ ۱۰ است. سرم چهار بیمار و پلاسمای یک بیمار که با سم پاراکوات آلوده شده بودند، مورد آنالیز قرار گرفتند، شناسایی و تشخیص نتایج مثبت به سرعت بدست آمد.یکی از این بیمارانی که زنده مانده بود نسبتا سریع سطوحی از پاراکوات را در بدنش نشان داد. بنابراین این روش برای ارزیابی پاراکوات در نمونه های سمی مناسب است.این ممکن است به عنوان یک ابزار پیش آگهی در موارد بحرانی سمیت زدایی و شناسایی سریع و پتانسیل قابلیت نجات بیماران و همچنین یک نقش محوری را در مطالعات جدید آنالیز خون ایجاد کند.(۳۹)

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۸ کروماتوگرافی گازی-اسپکترومتری جرمی; روشی برای تعیین علف کش پاراکوات و دی کوات در نمونه های پلاسما و ادرار
در این مطالعه نشان داده شد که این روش پیشرفته و بهینه شده به تشخیص علف کش پاراکوات ((PQ و دی کوات ((DQ در نمونه های ادرار و پلاسما انسانی کمک کرد. دستور العمل و روش ابتدایی با احیا شیمیایی آنالیتها با اضافه کردن بوروهیدرید سدیم به طور مستقیم به نمونه بافر با PH:8 انجام شد.این روش با تبدیل ماده اصلی آمونیوم چهار هسته ای به موارد بسیار فرار جهت آنالیز کروماتوگرافی گازی نیازمند است. این ترکیبات احیا شده با کارتریج C18 به روش استخراج فاز جامد، استخراج شدند. اتیل پاراکوات به عنوان استاندارد داخلی مورد استفاده قرار گرفت. کروماتوگرافی گازی -اسپکتروفوتومتری جرمی برای شناسایی و ارزیابی آنالیتها در روش پایش انتخاب یونی ( (SIMمورد استفاده قرار میگیرد. محدوده تشخیص برای هر دوی PQ ,DQ gr/Lµ ۰٫۵ بود. دقت روش های آنالیتیکی به مینیمم منحنی کالیبراسیون (از ۰٫۱ تا gr/Lµ ۵۰) r>0.98 بهبود پیدا کردند. این روش میتواند به عنوان یک ابزار پیشرفته برای تایید سوسپانسیون سم PQ,DQ و ارزیابی مقدار این سمیت مورد استفاده قرار بگیرد.(۴۰)
۲-۹ تعیین پاراکوات در نمونه های بیولوژیک توسط روش ساده شده استخراج فاز جامد و اسپکتروفوتومتری
اندازه گیری سریع مقادیر کم پاراکوات در مایعات بدن برای تشخیص و پیش آگهی در مسمومیت با سم پاراکوات یسیار حائز اهمیت است.این یک روش حساس و ساده برای تعیین سطوح کمتر از میکروگرم توسط روش استخراج فاز جامد به همراه روش اسپکتروفوتومتری است که توسعه زیادی پیدا کرده است. سرم ،ادرار و بافت های فیکس شده با فرمالین از طریق یک ستون عبور داده شده اند و پاراکوات با ۲ میلی لیتر سود دو نرمال الوت و جدا شد. مواد الوت شده با دی تیونیت احیا شدند و با دو مورد از این مشتقات به روش اسپکتروفوتومتریک تعیین کمیت شدند.کمتری حد تشخیص پاراکوات با این روش mgr/L 0.5 و برای مشتق صفر mgr/L 0.1 و mgr/L 0.005 و mgr/L 0.001 برای مشتق دوم، جهت ml 2سرم و ml 10برای ادرار یا فرمالین اندازه گیری شد. هدف از این روش حذف مداخله مواد بیولوژیک و به همان اندازه ایجاد یک روش با دقت بالاو کارایی عالی است.تمام این روش میتواند بدون هیچ مهارت ،معرف یا تجهیزات خاصی در ظرف ۳۰ دقیقه انجام شود.این نتایج نشان میدهند که این روش برای اهدافی چون سم شناسی پزشکی قانونی و کلینیکی مناسب باشد.(۴۱)
۲-۱۰ تخمین اورژانسی پاراکوات در پلاسما ،مقایسه روش RIA (رادیوایمونو اسی )و روش رنگ سنجی جفت یونی
یک مقایسه ای است بین روش رادیو ایمونواسی برای تشخیص پاراکوات در پلاسما و یک روش رنگ سنجی اصلاح شده به نام استخراج جفت یونی.این مقایسه بروی پلاسمای بیماران پذیرش شده با مسمومیت با پاراکوات انجام شد. ارتباط و همبستگی بین هر دوی این روشها خوب بود، و هر دوی این روش ها برای تخمین اورژانسی و سریع مناسب بودند.(۴۲)
۲-۱۱ یک روش ساده و مختصر برای تعیین پاراکوات در پلاسما
پاراکوات در پلاسما بعد از رسوب پروتین های پلاسما با اضافه کردن یک ترکیب حلال نمکی اندازه گیری شد. پاراکوات باقیمانده در محلول رویی توسط تشکیل رادیکالهای آزاد، بعد از اضافه کردن آلکالین دیتیونیت سدیم اندازه گیری شد. زمان لازم برای تعیین پاراکوات حدودا ۲۰ دقیقه است.(۴۳)
۲-۱۲ مقایسه روش شناسایی پاراکوات در خون توسط زئولیت با روش معمول شناسائی پاراکوآت در ادرار
روش معمول شناسائی پاراکوآت در ادرار روش دی تیونیت است دی تیونیت سدیم کاربردهای وسیعی در پزشکی صنعت و علوم زمین شناسی دارد. یکی از کاربردهای آن تعیین حضور پاراکوات و دی کوات در ادرار می باشد. برای این منظور معرف دی تیونیت سدیم را با نمونه ی ادرار مخلوط می کنند و چنانچه رنگ سبز تشکیل شد نشانه ی وجود دی کوات و چنانچه رنگ آبی تشکیل شد نشانه ی وجود پاراکوات است به این ترتیب که ۱میلی لیتر ادرار را با ۱ میلی لیتر معرف (Reagent) که محلول %۱وزنی حجمی دیتیونیت سدیم در سود یک مولار است، اضافه میکنیم که این محلول باید تازه باشد که اگر در نمونه ادرار ادرار پاراکوات باشد به رنگ آبی تغییر رنگ میدهد که حد تشخیص در اینجا میکروگرم در میلی لیتر است.اما موضوع بحث در این تحقیق اندازه گیری سطح پلاسمایی پاراکوات است که یک روش صحیح تر جهت پیش بینی وضع مسموم میباشد، به طوریکه در سطح پلاسمایی ۲ میلی گرم بر لیتر ،۴ ساعت پس از مصرف، و ۰٫۲ میلی گرم بر لیتر،۲۴ ساعت پس از مصرف و ۰٫۱میلی گرم بر لیتر، ۴۸ ساعت پس از مصرف مرگ اتفاق می افتد.پس به همین جهت اندازه گیری پاراکوات در پلاسما نسبت به تست دی تیونیت سدیم در ادرار ارجح تر میباشد.

شکل ۲-۱٫ نمای شماتیک استخراج کاتیون توسط یک رزین تبادل کاتیونی
فصل سوم
مواد و دستگاه های مورد نیاز و روش های پژوهش
۳-۱ وسایل ودستگاههای مورد نیاز:
۱٫الک میکروسایزرASTM استیل-مش سایز۴۰۰ ( ۳۷ میکرومتر)
۲٫ الک میکروسایزرASTM استیل-مش سایز ۸۰۰ (۱۶ میکرومتر)
۳Particle Size Analayzer
Hylro2005malvern instrument ((Master sizer
۴٫ میکروسکوپ الکترونی SEM
(Hitachi model s4160)Field-emission scaning electron microscope
۵٫ اسپکتروفتومتر (uv-visible)
۶٫ دستگاه BET(Generated by Quantachrome TPRWin v1.50)
۳-۲ مواد:
۱٫پاراکوات دی کلراید (Aldrich آمریکا)
۲٫پودر میکرونیزه کلینوپتیلولایت (زئولیت) (افرازند ایران)
۳٫سولفات آمونیوم (Merck آلمان)
۴٫اسید کلریدریک (Merck آلمان)
۵٫سدیم کلراید (Merck آلمان)
۶٫سود یک مولار (افرازند ایران)
۷٫پودر دیتیونیت سدیم (Merck آلمان)
۸٫رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید (Machery Nagel آلمان)
۹٫متانول (Merck آلمان)
۳-۳ خلاصه روش اجرای آزمایش:
۳-۴ تهیه پودر میکرونیزه کلینوپتیلولایت:
روش کار بدین صورت است که برای تهیه پودر میکرونیزه کلینوپتیلولایت با اندازه ذرات ۴۰-۱۱ میکرومتر ، پودر میکرونیزه کلینوپتیلولایت با اندازه ذرات کوچکتر از ۳۷ میکرومتر خریداری شده از شرکت افرازند را در آب مقطر بصورت سوسپانسیون درآورده و سپس از الک ۴۰۰mesh (µm37) عبور می دهیم، بخش عبور کرده از الک را دوباره در آب مقطر بصورت سوسپانسیون دراورده و از الک ۸۰۰ mesh (µm16) عبور می دهیم، بخش باقیمانده روی الک را به مدت ۲۴ ساعت در owen 250 درجه سانتی گراد خشک می کنیم، سپس جذب و رهایش پاراکوات از آن مورد بررسی قرار خواهد گرفت و سپس با یک رزین تبادل کاتیونی مشخص مثل رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید مقایسه خواهد شد. استخراج از فاز ثابت با بهره گرفتن از حلالهای حاوی کلرید سدیم صورت خواهد گرفت و میزان پاراکوات استخراج شده پس از سانتریفیوژ حاصل استخراج و واکنش با معرف دی تیونیت سدیم و اندازه گیری میزان جذب مرئی کمپلکس آبی ایجاد شده در طول موج مناسب، اندازه گیری شده و در نهایت مقدار پاراکوات استخراج شده از هر دو فاز ثابت با بهره گرفتن از کالیبراسیون پاراکوات به دست خواهد آمد و در نهایت ، پاراکوات در نمونه های خون افراد مسموم با پاراکوات با بهره گرفتن از هر دو فاز ثابت استخراج خواهد شد و کارایی کلینوپتیلولایت در استخراج پاراکوات مشخص خواهد شد.
۳-۵ روش کلی انجام آزمایش:
ابتدا یک سوسپانسیون ۵ گرم زئولیت در ۵۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه کرده و بمدت ۲۴ ساعت بر روی مگنت استیرر قرار می دهیم تا زئولیت، فعال شده و آماده واکنش با پاراکوآت شود. سپس یک بورت به قطر ۲ سانتی متر انتخاب کرده و در کف آن مقداری پنبه قرار داده و سوسپانسیون زئولیت را به آن می افزائیم. سپس شیر بورت را باز کرده تا آب اضافی از آن خارج شود تاحدی که سطح آب به بالای فاز ثابت برسد. در این حالت، مقدار ۵ میلی گرم استاندارد پاراکوات هیدروکلراید در ۱ میلی لیتر آب مقطر را به فاز ثابت می افزائیم و شیر بورت را باز می کنیم بطوریکه سرعت خروج مایع بیش از ۱ میلی لیتر در دقیقه نباشد. بعد از خروج کامل مایع، از حلالهای مختلف با قطبیت و قدرت یونی متفاوت جهت استخراج پاراکوآت از فاز
ثابت استفاده می کنیم و به این نکته توجه داریم که یکی از اجزاء حلالها حتما” باید سدیم کلراید باشد چرا که اولا” دارای کاتیون سدیم است که قدرت یونی بیشتری نسبت به پاراکوآت دارد و ثانیا” دارای یون کلراید است که پاراکوات را بصورت ملح هیدروکلراید درآورده که راحت تر از فاز ثابت جدا می شود. همین کارها را با رزین تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید شرکت Machery Nagel که دارای خاصیت تبادل کاتیونی است، انجام می دهیم. بعد برای اندازه گیری پاراکوآت استخراج شده، به ۱ میلی لیتر از حاصل استخراج، ۱ میلی لیتر معرف دی تیونیت سدیم ۱/۰% در سود ۱ مولار می افزائیم و جذب نوری کمپلکس آبی رنگ ایجاد شده را در طول موج nm 5/394 قرائت می کنیم. برای بررسی استخراج پاراکوآت از خون با بهره گرفتن از این دو رزین، رزینها را مانند بالا آماده سازی کرده و سپس به ۵ میلی لیتر نمونه خون از افراد سالم ۵ میلی گرم استاندارد پاراکوات هیدروکلراید اضافه می کنیم و پس از رسوب دادن پروتئین ها با متانول و صاف کردن مخلوط، حاصل را به فاز ثابت اضافه می کنیم و بقیه مراحل را مانند بالا ادامه می دهیم. برای کامل شدن نتایج، عمل استخراج را بر روی چند نمونه خون از مسمومین با پارکوآت نیز انجام می دهیم. میزان بازیابی (Recovery) را از طرق نسبت جذب حاصل استخراج به محلول استاندارد پاراکوات دی کلراید با غلظت اضافه شده بدست می آوریم. میزان پاراکوآت استخراج شده پس از سانتریفوژ حاصل استخراج و اندازه گیری میزان جذب ماوراء بنفش محلول روئی در طول موج مناسب، اندازه گیری شده و در نهایت مقدار پاراکوآت استخراج شده از هر دو فاز ثابت با بهره گرفتن از منحنی کالیبراسیون (استاندارد) پاراکوآت بدست خواهد آمد.
برای رسم منحنی استاندارد پاراکوآت در آب مقطر ابتدا یک محلولی از پاراکوآت در آب قطر تهیه می کنیم که جذب ۱ را در طول موج ماکزیمم جذب ایجاد کند. سپس از این محلول با بهره گرفتن از ،serial dilution4 غلظت دیگر تهیه می کنیم و جذب محلولهای فوق را در این طول موج بدست آورده و منحنی استاندارد را با رسم جذب در برابر غلظت محلولهای مختلف پاراکوآت می سازیم.
سطح ویژه(Specific surface; BET)ذرات کلینوپتیلولایت اندازه گیری خواهد شد تا مساحت سطحی هر گرم از این ماده بدست آید. همچنین سطح و شکل ذرات این ماده با بهره گرفتن از میکروسکوپ الکترونی SEM بررسی و عکسبرداری خواهد شد.اندازه ذرات کلینوپتیلولایت الک شده توسط دستگاه پارتیکل سایز آنالایزر اندازه گیری خواهد شد. پتانسیل زتا ذرات کلینوپتیلولایت الک شده توسط دستگاه زتا سایزر اندازه گیری خواهد شد.
۳-۶مشخصات ابزار جمع آوری اطلاعات و نحوه جمع آوری آن:
شکل ذرات کلینوپتیلولایت با بهره گرفتن از میکروسکوپ الکترونی SEM تعیین می شود. میزان پاراکوآت جذب شده و آزاد شده از کلینوپتیلولایت با بهره گرفتن از اندازه گیری جذب نور ماوراء بنفش محلول روئی مخلوط سانتریفوژ شده حاصل استخراج شود.که با معرف دی تیونیت سدیم ۱/۰% در سود ۱ مولار واکنش داده شده است در طول موج ۳۹۴٫۵nm، اندازه گیری شده و در نهایت مقدار پاراکوآت جذب شده و آزاد شده از کلینوپتیلولایت با بهره گرفتن از منحنی کالیبراسیون پاراکوآت بدست خواهد آمد.سطح ویژه (Specific surface; BET) ذرات کلینوپتیلولایت با بهره گرفتن از دستگاه BET اندازه گیری خواهد شد. اندازه ذرات کلینوپتیلولایت الک شده توسط دستگاه پارتیکل سایز آنالایزر اندازه گیری خواهد شد. پتانسیل زتا ذرات کلینوپتیلولایت الک شده توسط دستگاه زتا سایزر اندازه گیری خواهد شد.
۳-۷ روش محاسبه حجم نمونه و تعدادآن:
چون این مطالعه بر روی حیوانات آزمایشگاهی صورت نمی گیرد، لزومی به محاسبه حجم نمونه نمی باشد و بجای آن میزان حداکثر جذب و رهایش پاراکوآت به ازای هر گرم کلینوپتیلولایت محاسبه می گردد.
۳-۸ روش محاسبه limit of Detection ((LOD: ۱۰ بار جذب بلانک را قرائت کرده و انحراف معیار آن را محاسبه میکنیم. سپس آن را در عدد۳ ضرب کرده و بر شیب خط استاندارد مربوطه تقسیم میکنیم.