پس از انکوباسیون یک قطره از شناساگر ۱ به لوله افزوده ­شد.
از شناساگر دو، ۲ قطره به لوله افزوده شد.
از شناساگر سه، ۲ قطره به لوله افزوده ­شد.
به محض افزودن شناساگر سه، تغییر رنگ صورتی باید دیده می­شد.
۳-۵-۲-۴. استاندارد­های احیاء نیترات
محلول­های استوک
۱- ۰۶۷/۰ مولار فسفات دی سدیم (۴۷/۹ گرم از Na₂HPO₄ در ۱۰۰۰ میلی­لیتر آب مقطر)
۲- ۰۶۷/۰ مولار فسفات مونو پتاسیم (۰۷/۹ گرم از KH₂PO₄ در ۱۰۰۰ میلی­لیتر آب مقطر)
۳- ۰۶۷/۰ مولار تری سدیم فسفات (۴۷/۲۵ گرم از Na₃PO₄ با ۱۲ مولکول آب در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر)
۴- فنل فتالئین ۱ درصد (۱ گرم پودر فنل فتالئین در ۱۰۰ میلی­لیتر از اتیل الکل ۹۵ درصد)
۵- برم تیمول بلو ۱ درصد (۱ گرم پودر برم تیمول بلو در ۱۰۰ میلی­لیتر اتیل الکل ۹۵ درصد)
۵A- 01/0 درصد برم تیمول بلو: ۱ میلی­لیتر از محلول شماره ۵ در ۱۰۰ میلی­لیتر آب مقطر مخلوط گردید.
محلول Working Buffer
استوک­های زیرا طبق دستور با مقادیر تعیین شده مخلوط ­شدند:
استوک شماره ۱: ۳۵ میلی­لیتر
استوک شماره ۲: ۵ میلی­لیتر
استوک شماره ۳: ۱۰۰ میلی­لیتر
آماده ­سازی استانداردها
۸ لوله آزمایشگاهی تمیز انتخاب ­شد و بترتیب شماره­گذاری ­شدند (۱ تا ۸).
در لوله­های شماره ۲ تا ۸ مقدار ۲ میلی­لیتر از محلول Working Buffer ریخته ­شد.
به ۱۰ میلی­لیتر از محلول Working Buffer 1/0 میلی­لیتر از استوک شماره (۴) و ۲/۰ میلی­لیتر از استوک شماره (A5) اضافه ­شد.
از محلول © 2 میلی­لیتر برداشته و به لوله شماره ۱ اضافه ­گردید (این یک رنگ (۵+) استاندارد بود)
از محلول © 2 میلی­لیتر برداشته و به لوله شماره ۲ در این مجموعه اضافه ­شد، کاملا” مخلوط شده و ۲ میلی­لیتر از همین لوله به لوله شماره ۳ اضافه ­شد. این نحوه سریال و تهیه رقت به میزان ۲ میلی­لیتر تا لوله شماره ۸ ادامه داده می­شد سپس از لوله شماره ۸، ۲ میلی­لیتر دور ریخته ­شد.
پس رنگ­های استاندارد آماده شامل: لوله شماره ۱ (۵+)، لوله شماره ۲ (۴+)، لوله شماره ۳ (۳+)، لوله شماره ۵ (۲+)، لوله شماره ۶ (۱+) و لوله شماره ۸ (±) بود. رنگ این لوله­ها از صورتی (±) تا قرمز متمایل به ارغوانی (۵+) بود.
لوله­های شماره ۴ و ۷ دو ریخته و مابقی لوله­ها اتوکلاو ­شدند و بعد از نشانه­گذاری در ۵ درجه سانتی ­گراد نگهداری ­گردیدند.
۳-۵-۳. تست کاتالاز
آنزیم کاتالاز یک آنزیم محلول و درون سلولی است که می ­تواند پراکسید هیدروژن را طی عمل شکافتن تبدیل به آب و اکسیژن نماید، پس از انجام این واکنش در محیط مربوطه، حبابهای اکسیژن کاملا” نمایان گشته که این حباب­ها معرف فعالیت آنزیم کاتالاز در محیط می­باشند.
تقریبا” همه مایکوباکتریوم­ها حاوی آنزیم کاتالاز هستند البته موتانت­هایی ازM. tuberculosis و بوویس مقاوم به ایزونیازید، این آنزیم را ندارند.
۳-۵-۳-۱. محیط و مواد مورد نیاز
بافر فسفات ۰۶۷/۰ مولار با pH=7 ، توئین ۸۰ ده درصد (۱۰%)، پراکسید هیدروژن ۳۰%، لوله­های درپیچ­دار، بن ماری
معرف­ها: توئین ۸۰ ده درصد (۱۰%) ، پراکسید هیدروژن ۳۰%
۳-۵-۳-۲. آماده ­سازی محلول­های تست کاتالاز
توئین ۸۰ ده درصد
۱۰ سی­سی از توئین ۸۰ با ۹۰ سی­سی آب مقطر مخلوط ­گردید و در دمای ۱۲۱ درجه سانت­گراد به مدت ۱۰ دقیقه اتوکلاو ­شد. بعد از عمل اتوکلاو محلول فورا” تکان داده شد اما در طول خنک شدن ثابت نگه داشته شدند.
محلول­های استوک
برای تهیه دی سدیم فسفات ۱۵ مولار (Na₂HPO₄) در یک فلاسک مدرج ۴۷/۹ گرم Na₂HPO₄ بدون آب، اضافه با کمی آب مقطر حل ­شد و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی­لیتر ­رسید.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

برای تهیه مونو پتاسیم فسفات ۱۵ مولار (KH₂PO₄) در یک فلاسک مدرج ۰۷/۹ گرم KH₂PO₄ اضافه، سپس با کمی آب مقطر حل ­شد و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی­لیتر ­رسید.
برای تهیه محلول بافر با pH=7 ، ۱/۶۱ میلی­لیتر از استوک ۱ با ۹/۳۸ میلی­لیتر از استوک ۲ مخلوط ­گردید و pH اندازه گیری ­شد.
تهیه معرف تست کاتالاز: این معرف از مقدار مساوی توئین۸۰ ده درصد و پراکسید هیدروژن ۳۰ درصد آماده ­شد.
۳-۵-۳-۳. مراحل انجام آزمایش روش نیمه­کمی کاتالاز و کاتالاز ۶۸ درجه
برای هر سوش دو لوله در پیچ­دار انتخاب ­شد (یکی برای R.T و دیگری برای کاتالاز ۶۸).
میزان ۵/۰ میلی­لیتر بافر فسفات داخل لوله آزمایش در پیچ­دار ریخته ­شد و سپس یک لوپ پر از ارگانیسم مورد نظر داخل آن حل ­گردید.
سوسپانسیون­ها در دمای اتاق و ۶۸ درجه به مدت ۲۰ دقیقه قرار ­گرفتند.
قبل از افزودن معرف­ها لوله­ها در دمای اتاق خنک ­شدند، سپس ۵/۰ میلی­لیتر از توئین۸۰ ده درصد و پراکسید هیدروژن ۳۰% به آنها افزوده گردید، درب لوله­های آزمایش شل بسته ­شد.
جهت تشکیل حباب­های اکسیژن پس از افزودن ۲ محلول فوق، لوله­هایی که حبابی تشکیل ندادند، منفی محسوب ­شدند. برای اطمینان بیشتر، لوله­ها را ۲۰ دقیقه نگه داشته و سپس دور ریخته شدند.
۳-۵-۳-۴. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز
یک آزمایش مثبت تشکیل حباب­های اکسیژن را نشان می­داد و یک آزمایش منفی حبابی را نمایان نمی­ساخت.M. tuberculosis ، بوویس، گاستری و هموفیلوم فعالیت کاتالازی آنها در دمای ۶۸ از بین می­رود ولی در دمای اتاق تمام مایکوباکتریوم­ها کاتالاز مثبت هستند.
۳-۵-۴. حساسیت به تیوفن ۲- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH)
ممانعتTCH از رشد M. bovis کمک بسیار مفیدی در تشخیص آن از سایرمایکوباکتریوم­ها بویژهM. tuberculosis می­ کند. در این روش ۱۰۰ml از سوسپانسیون باکتری بر روی محیط LJ حاوی ۱۰µgr/ml TCH و محیط شاهد بدون دارو به مدت ۲ تا ۳ هفته در گرمخانه نگه­داری ­شدند. ازسویهM. tuberculosis استاندارد به عنوان شاهد مقاوم و از M. bovis استاندارد عنوان شاهد حساس استفاده ­شد.
۳-۶. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریوم­ها
بر طبق استاندارد­های CDC بر روی کشت­های LJ حاوی کلونی­هایM. tuberculosis تست حساسیت دارویی نسبت به آنتی­بیوتیک ریفامپین µg/ml40، ایزونیازید µg/ml2/0، استرپتومایسین ۱۰µg/ml، اتامبوتول µg/ml2، کاناماسین µg/ml20 و اتیونامید µg/ml20 به روش تناسبی (proportional) انجام ­گرفت . (Farnia P. et al., 2004)
سوسپانسیونی از باکتری مطابق ۱ مک فارلند مورد مطالعه بر روی محیط کشت LJ که داروهای مورد نیاز با غلظت­های معین به آن افزوده شده بود تلقیح داده ­شد و نتایج آزمایش ۲۸ روز بعد از تلقیح قرائت گردید. تعداد کلونی­ها در سطح محیط حاوی دارو، تعداد باسیل­های مقاوم به آن را مشخص کرد. نسبت تعداد باسیل­ها مقاوم به هر دارو به تعداد باسیل­های زنده در ماده تلقیح شده اگر از حدی که نسبت بحرانی برای مقاومت نامیده می­ شود کمتر باشد، باسیل نسبت به آن دارو حساس و اگر معادل آن حد یا بیشتر باشد سویه مقاوم تلقی می­ شود.
۳-۶۱. تهیه محلول استاندارد مک فارلند
استاندارد مک فارلند تعدا باکتری­ ها در ۱cc سوسپانسیون را نشان می­دهد. یک مک فارلند ۳×۱۰^۸ باکتری دارد. از خصوصیات مهم استاندارد مک فارلند این است که در هر آزمایشگاه بدون در اختیار داشتن وسیله خاصی و فقط با بهره گرفتن از مک فارلند می­توان مقدار باکتری را ارزیابی کرد. برای تهیه این محلول ۹۹۰ ml اسید سولفوریک ۱% به ۱۰ ml کلرید باریم ۱% اضافه ­گردید. ۶-۴ میلی­لیتر از محلول استاندارد تهیه شده در لوله­های در پیچ دار هم اندازه ریخته و درب لوله­ها محکم بسته شد و در تاریکی و در دمای اتاق نگه­داری ­گردید.