۲/۲

MgSO4. 7 H2O

Scharlau

۱/۰

FeSO4. 7 H2O

Merck

۱/۰

MnSO4. 5 H2O

Scharlau

۰۸/۰

ZnSO4. 7 H2O

Merck

۲/۲

K2SO4

Merck

۰۲/۰

H3BO3

Merck

۰۸/۰

CuSO4

۲-۲- انتقال میکروارگانیسم از یخ خشک به محیط کشت اولیه
قبل از شروع عمل انتقال، سطح زیر هود[۵۰] توسط پنبه آغشته به الکل ۷۰% کاملا ضدعفونی گردید. عمل ضدعفونی در مورد کپسول شیشهای محتوی میکروارگانیسم و ارلنهای محیط کشت نیز انجام گرفت. کپسول شیشهای حاوی باکتری خشکشده از محل بالای توده پنبه خراش داده شد، محل خراش روی شعله گرفته شد و بلافاصله بر روی محل خراش، آب مقطر استریل ریخته شد تا شیشه شکسته شود ( از مرطوب کردن زیاد محل خراش خودداری شد، زیرا ممکن است در اثر شکستن خلاء، آب به داخل شیشه کشیده شود). توده پنبه با یک پنس استریل خارج شد و در شرایط استریل حدود ۵/۰ میلی لیتر با سرنگ از محیط کشت مایع به ماده خشک موجود در شیشه حاوی نمونه افزوده شد. پس از چند بار پر و خالی کردن شیشه توسط سرنگ، مخلوطی یکنواخت حاصل شد و به هر محیط کشت مقدار ۲ تا %۵ کل حجم آنها اضافه گردید. محیط تلقیح شده در دمای مناسب رشد باکتری (C‍‍‍º ۳۰) به مدت ۵ روز نگهداری گردید. پس از گذشت ۵ روز و اطمینان از رشد مطلوب میکروارگانیسم، نمونه ها جهت استفاده در آزمایشات بعدی به داخل یخچال (C‍‍‍º ۴) منتقل شدند.
۲-۳- محیط نگهداری
مناسبترین محیط جهت رشد و نگهداری باکتریها محیط کشت جامد میباشد. در این مطالعه از محیط کشت پیشنهادی بانک میکروبی آلمان (DSMZ, Medium 81) برای تجدید کشت استفاده شد. جهت تهیه محیط کشت جامد، ابتدا محیط کشت مایع (جدول ۲-۱) تهیه شده را روی هیتر[۵۱] (ARE, EU) گذاشته و آگار تدریجا به آن افزوده شد. مقدار ۵ میلیمتر از محیط آگار تهیه شده، قبل از اتوکلاو در داخل لوله های آزمایش ریخته شد. به اندازهای که زمانی که لوله را شیبدار قرار دادیم از سر لوله تا انتهای آن با یک شیب ملایم امتداد یافت. این روش لزوما برای افزایش سطح بیشتر آگار در داخل لوله انجام پذیرفت. پس از پایان اتوکلاو، لولههای آزمایش محتوی آگار را به صورت شیبدار قرار داده تا آگار بسته شود. پس از سرد شدن محیطکشت آگار، با بهره گرفتن از مخمر موجود در محیطکشت رشد، آنها را تلقیح کرده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای مناسب C‍‍‍º ۳۰ نگهداری شدند تا رشد میکروارگانیسم صورت پذیرد. پس از رشد میکروارگانیسم محیط کشت تلقیح در دمای C‍‍‍º ۴ در یخچال نگهداری شد. محیط کشت تلقیح هر ماه یکبار جایگزین میگردید.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۴- محیط کشت تلقیح[۵۲]
محیط کشت تلقیح جهت تهیه بیشترین توده سلولی فعال برای تلقیح به محیط کشت اصلی است بطوری که در کمترین زمان بیشترین بهره وری حاصل شود. باید به این نکته توجه داشت که هر چه ترکیبات و شرایط رشد محیط تلقیح و فرایند بیولوژیکی متفاوتتر باشد فاز تاخیر رشد باکتری برای سازگاری با محیط جدید طولانیتر خواهد شد. مواد ذکر شده در جدول ۲- ۱ به عنوان مواد تشکیل دهنده محیط کشت تلقیح مورد استفاده قرار گرفت.
۲-۵- محیط کشت فرایند بیولوژیکی
مواد شیمیایی ذکر شده در جدول ۲-۱ بعنوان محیط کشت فرایند بیولوژیکی در آزمایشات اصلی مورد استفاده قرار گرفته است. Na2HPO4، Fe(NH4)Citrate و NaHCO3 جهت جلوگیری از ایجاد رسوب بصورت جداگانه اتوکلاو گردیدند. منبع کربن نیز بطور جداگانه تهیه و استریل شد تا از کاراملی شدن منبع قند یا به اصطلاح از پدیده قهوهایشدن[۵۳] جلوگیری شود. پس از استریلنمودن تمامی اجزای محیطکشت منبع کربن، نمکهای نیترات و فسفات در زیر هود لامینار و نزدیک شعله به همدیگر افزوده شده بودند. بعد از مخلوط شدن، محلولی شفاف از محیط کشت جهت آزمایشات حاصل گردید.
۲-۶- آماده سازی کشت تلقیح
محیط کشت مایع مطابق با جدول ۲-۱ به میزان ۱۵۰ میلیلیتر در یک ارلن ۵۰۰ میلیلیتری تهیه گردید و پس از استریلشدن و رسیدن به دمای محیط، عمل تلقیح صورت گرفت. سپس در فواصل زمانی منظم (هر ۱۲ ساعت) و بمدت ۱۴۴ ساعت، نمونهبرداری جهت تعیین میزان جذب و میزان مصرف گلوکزصورت پذیرفت. میزان جذب نمونه ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Jenway 6305, UK) و در طول موج ۶۲۰ نانومتر قرائت گردید. از آب مقطر نیز بعنوان شاهد استفاده شد. گلوکز نیز با بهره گرفتن از روش DNS [۵۴] تعیین گردید.
۲-۷- شرایط فرایند بیولوژیکی و نمونه برداری
در بخش اول از سیستم غیرپیوسته[۵۵] بصورت ارلن مایر استفاده شد. ۲۰۰ میلیلیتر از محیط کشت فرایند بیولوژیکی در ارلنهای ۱ لیتری تهیه و سپس ۱۰ میلیلیتر (۵% حجم محیط کشت تازه) از محیط کشت تلقیح به آنها افزوده شد. برای هوادهی یکنواخت داخل هر ارلن مگنتی قرار داده شد. سپس ارلنها در داخل انکوباتور همزن دار[۵۶](Lovibond, Germany) با سرعت rpm 250 و با دمای C‍‍‍º۳۰ قرار داده شدند. جهت درک روند تغییرات، به مدت ۴ روز و هر ۱۲ ساعت و در مجموع۹۶ ساعت از محیط کشت نمونهگیری صورت گرفت. در هر نمونهگیری ۶ میلیلیتر از محیط کشت تحت شرایط کاملا استریل و در زیر laminar flow برداشت شد. از این مقدار ۱ میلیلیتر جهت سنجش دانسیته نوری[۵۷] مورد استفاده قرار گرفت. ۵ میلیلیتر باقیمانده از نمونه بالا به مدت ۲۰ دقیقه و با سرعت rpm 3000، سانتریفیوژ (Hermel, Germany) گردید. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی[۵۸] جهت آنالیز مقدار گلوکزو فروکتوز مورد استفاده قرار گرفت. سلول باقیمانده در انتهای لوله نیز برای استخراج و سنجش نوع و میزان پلیمر تولیدی استفاده گردید.
۲-۸- تهیه منحنی کالیبراسیون وزن خشک سلولی- جذب
۱۵۰ میلیلیتر از محیط کشت، در ارلن ml500 تهیه گردید. پس از اتوکلاو تا هنگام سرد شدن به حال خود گذاشته شد. سپس کشت تلقیح[۵۹] بمیزان ۵% حجمی به محیط کشت افزوده شد و به مدت ۱۸ ساعت در دمای محیط قرار گرفت تا به فاز رشد نمایی رسید. حجمهای مختلف ۱، ۲، ۳، ۴، ۵، ۶، ۷، ۸، ۹ و ۱۰ میلیلیتر از باکتری رشد داده شده، در ۱۰ سری لوله آزمایش ریخته شد و تمامی آنها با آب مقطر به حجم ۱۰ میلیلیتر رسانده شدند. میزان جذب محلولهای تهیه شده با دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج nm620 اندازه گیری شد (از آب مقطر به عنوان شاهد در قرائت نمونه ها با اسپکتروفتومتر استفاده گردید). در مرحله بعد، تعداد ۱۰ عدد فیلتر ۴۵/۰ میکرون را از ۱ تا ۱۰ شمارهگذاری گردید و به مدت ۱۶ ساعت در آون با دمای oC50 قرار داده شد. پس از سردشدن فیلترها، آنها را توزین نموده و ۱ میلیلیتر از هر یک از محلولهای باکتری، با غلظتهای مختلف از فیلترهای خشکشده گذرانده شد و مجدداً به مدت ۱۶ ساعت در داخل آون در دمای oC80 قرار گرفت. پس از خشکشدن و تعیین وزن ثانویه، وزن خشک سلولی[۶۰] (CDW) برای هر یک از غلظتها بدست آمد. منحنی های کالیبراسیون میزان جذب و وزن خشک سلولی در پیوست نشان داده شده است که در ادامه آزمایشات جهت محاسبه وزن خشک سلولی بکار گرفته شد.
۲-۹- تهیه منحنی های کالیبراسیون جهت تعیین مقادیر منابع کربن
۲-۹-۱- طرز تهیه محلول معرف DNS
هیدرواکسید سدیم ۲ مولار (Merck) به عنوان محلول مادر[۶۱] برای تهیه محلول DNS مورد استفاده قرار گرفت. در ابتدا ۲۰ گرم NaOH را در آب دیونیزه حل کرده و در بالن حجمی[۶۲] به حجم ۲۵۰ میلیلیتر رسانده شد. پس از سرد شدن ۱۰ گرم، ۳و۵- دی نیترو سالیسیلیک اسید به ۲۰۰ میلیلیتر از سود ۲ مولار اضافه گردید. ترکیب بدست آمده روی هیتر گذاشته شد و یک مگنت برای هم زدن محلول درون آن قرار داده شد تا نمک کاملاً حل شد. همزمان با این کار ۳۰۰ گرم، پتاسیم سدیم تارتارات (Merck) را به طور جداگانه در۲۰۰ میلیلیتر آب دیونیزه ریخته و گرم کردیم تا کاملا حل شد. در نهایت هر دو محلول را در شرایطی که کاملا داغ بودند به یکدیگر افزوده شدند. جهت جلوگیری از ایجاد رسوب، این مرحله بدون تاخیر انجام گردید. پس از سرد شدن آن را داخل یک ارلن حجمی ۱ لیتری ریخته و با آب دیونیزه به حجم رسانیده شد[۱۰۱].

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...