۸/۲۱

۱/۱۶

۵/۳۱

III

۴/۲۸

۳/۲۲

۹/۱۶

۴/۳۲

IV

۵/۲۱

۵/۲۷

۳/۱۷

۷/۳۳

V

۴/۶

۹/۴۲

۵/۱۷

۲/۳۳

آنالیز داده ها با نرم افزار CDNN صورت گرفت. I) نمونه تازه تهیه شده انسولین، II) نمونه انسولین انکوبه در غیاب آسپیرین به مدت ۲۰ روز، III) نمونه انسولین انکوبه در غیاب آسپیرین به مدت ۳۶ روز،IV ) نمونه انسولین استیله شده با آسپیرین به مدت ۲۰ روز وV ) نمونه انسولین استیله شده با آسپیرین به مدت ۳۶ روز.
۴-۶- مطالعه ساختار سوم انسولین استیله با روش فلورسانس ذاتی و محیطی
مطالعه فلورسانس ذاتی و محیطی به منظور بررسی تغییرات ساختار سوم پروتئین انسولین حاصل از فرایند استیلاسیون در حضور آسپیرین انجام شد. اگر چه هورمون انسولین فاقد اسید آمینه تریپتوفان است اما در ساختارش دارای چهار آمینواسید تیروزین شامل ,TyrA₁₄ TyrA₁₉، TyrB₆ و TyrB₂₆ است (Menendez و همکاران ۱۹۶۹). تغییر قطبیت (پلاریته) محیط اطراف این تیروزین ها متأثر از عوامل فیزیکی- شیمیایی بوسیله دستگاه فلورسانس و از طریق ثبت طیف نشری مولکول قابل ردیابی است. فلورسانس ذاتی با برانگیختن اسید آمینه ی تیروزین در طول موج ۲۷۶ نانومتر و جمع آوری طیف نشری حاصل در محدوده ی طول موج های ۲۸۰ تا ۶۰۰ نانومتر انجام گرفت. همانطور که در شکل ۴-۶ مشاهده می شود نشر فلورسانس ذاتی نمونه استیله انسولین در هر دو زمان انکوباسیون پایین تر از نمونه ی طبیعی می باشد. این نتایج حاکی از آن است که با اعمال تغییرات ساختاری ضمن استیلاسیون انسولین قطبیت محیط اطراف تیروزین ها تغییر می یابد.
شکل ۴-۶- طیف نشری فلورسانس ذاتی نمونه های مختلف انسولین.
طیف نشری فلورسانس تیروزین نمونه های انکوبه شده برای ۲۰ روز (A) و ۳۶ روز (B) که در طول موج ۲۷۶ نانومتر برانگیخته شد. حروف F، N و Ac به ترتیب مربوط به انسولین تازه تهیه شده، انسولین طبیعی و انسولین استیله می باشد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

برای بررسی دقیق تر تغییرات ساختاری انسولین در حضور آسپیرین از مطالعه ی فلورسانس محیطی با فلور عارضی ANS استفاده شد. ANS پروب فلورسانسی است که اغلب به سطوح آبگریز مولکول متصل می شود و ضمن اتصال در صورت تهییج در طول موج ۳۶۵ نانومتر، در محدوده ۴۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر نشر خواهد داشت. پروب ANS به تنهایی نشر کمی دارد اما بعد از اتصال به پروتئین انسولین شدت نشر آن به سمت طول موج های کمتر افزایش می یابد. نتایج به دست آمده از مطالعه فلورسانس محیطی در شکل ۴-۷ نشان می دهد که شدت نشر فلورسانس ANS نمونه ی انسولین استیله شده برای ۲۰ و ۳۶ روز در مقایسه با نمونه های انسولینی کنترل و تازه تهیه شده بیشتر می باشد. کاهش محسوس نشر فلورسانس ANS نمونه ی استیله در مدت زمان ۳۶ روز در مقایسه با مدت ۲۰ روز به علت تغییرات ساختاری بیشتر و افزایش معنی دار سطوح آبگریز در معرض پروتئین می باشد. به طور کلی می توان گفت که استیلاسیون انسولین منجر به تغییر قطبیت محیط اطراف تیروزین و افزایش سطوح آبگریز در معرض انسولین می گردد. این تغییرات سبب افزایش تمایل پروتئین برای تشکیل فیبر آمیلوئید در نمونه ی استیله شده برای ۳۶ روز در حضور آسپیرین می شود.
شکل ۴-۷- طیف نشری فلورسانس عارضی نمونه های مختلف انسولین.
طیف نشری فلورسانس عارضی نمونه های انکوبه شده برای ۲۰ روز (A) و ۳۶ روز (B) در محدوده ی طول موج های ۴۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر که در طول موج ۳۶۵ برانگیخته شد. در این مطالعه غلظت انسولین و تیوفلاوین T به ترتیب ۱۵/۰ میلی گرم در میلی لیتر و ۵۰ میکرومولار بود. حروف F، N و Ac به ترتیب نشان دهنده ی انسولین تازه تهیه شده، انسولین غیر استیله و انسولین استیله می باشد.
۴-۷- مطالعه کشش سطحی انسولین نمونه های مختلف انسولینی
خاصیت دوگانه دوستی پروتئین ها ناشی از وجود زنجیره های جانبی آبگریز و آبدوست می باشد. مناطق آبگریز جذب سطح هوا می گردند. هرگونه تغییر در خصوصیات فیزیکی- شیمیایی پروتئین مانند تغییرات ساختار فضایی سبب تغییرِ کشش سطحی آن می گردد (Messina و همکاران ۲۰۰۶). از این رو می توان با مطالعه ی کشش سطحی محلول پروتئینی میزان آبگریزی آن را تعیین نمود.
در این مطالعه کشش سطحی نمونه های انسولین تازه تهیه شده، انسولین طبیعی و انسولین استیله در سطح آب/هوا بررسی شد. میزان کشش سطحی برای نمونه انسولین تازه تهیه شده قبل از مطالعه mN/m 48/51 اندازه گیری شد. نمونه های انسولین انکوبه شده در غیاب آسپیرین در مدت زمان ۲۰ و ۳۶ کاهش میزان کشش سطحی را نشان می دهند و به ترتیب برای زمان های ۲۰ و ۳۶ روز mN/m82/49 و mN/m75/41 می باشد. این کاهش در مورد نمونه ی انسولین انکوبه شده در مدت ۳۶ روز در مقایسه با همتای آن در مدت ۲۰ روز محسوس تر می باشد. میزان کشش سطحی در نمونه های استیله شده در مدت زمان ۲۰ و ۳۶ روز به ترتیب mN/m 34/53 و mN/m 24/54 محاسبه شد. کشش سطحی به عنوان عامل وابسته به آبگریزی پروتئین مطرح می باشد. کاهش میزان کشش سطحی پروتئین را می توان با افزایش محتوای سطح آبگریز در معرض آن توضیح داد (Gibson و همکاران ۲۰۰۵). با توجه به نتایج حاصل از مطالعه ی نشر فلورسانس ANS نمونه های مختلف انسولینی (شکل ۴-۷) انتظار می رفت که کشش سطحی نمونه های استیله شده نیز کاهش یابد. نیروهای بین مولکولی برروی خصوصیات فیزیکی مواد مانند کشش سطحی تاثیر دارد. نیروهای بین مولکولی قوی تر باعث افزایش کشش سطحی می شوند(Ghatee و همکاران ۲۰۱۱). به نظر می رسد که با اتصال گروه استیل به آمین های آزاد در انسولین نیروهای بین مولکولی قوی تری در سطح آب ایجاد می گردد که این امر باعث افزایش کشش سطحی نمونه های استیله شده می شود (شکل ۴-۸).
شکل ۴-۸- مطالعه ی تغییرات کشش سطحی نمونه های متفاوت انسولین طی انکوباسیون در مدت زمان ۲۰ و ۳۶ روز.
کشش سطحی نمونه های انسولین تازه تهیه شده(F)، انسولین طبیعی(N) و انسولین استیله محاسبه شد. داده های گزارش شده میانگین ده بار اندازه گیری می باشد و میله های عمودی نمایانگر انحراف معیار است. ستاره ها نمایانگر معنی داری با P<0.05 در مقایسه با نمونه انسولین تازه تهیه شده است.
۴-۸- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین بعد از فرایند استیلاسیون
پروتئین انسولین (۲ میلی گرم درمیلی لیتر) در حضور و عدم حضور غلظت ۱۵ میلی مولار آسپیرین در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pH و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ و ۳۶ روز انکوبه شد. سپس طیف هر یک از نمونه های انسولینی در محدوده ی طول موج های ۲۰۰ تا ۷۰۰ نانومتر به وسیله ی دستگاه اسکتروفتومتر ثبت شد. میزان جذب پروتئین در طول موج های بالاتر از ۳۲۰ نانومتر نشان دهنده ی توده ای شدن پروتئین تحت شرایطِ اعمال شده می باشد. همانطور که در شکل ۴-۸ مشاهده می شود در طیف جذبی نمونه های انسولین انکوبه شده در غیاب آسپیرین به مدت ۲۰ و ۳۶ روز افزایش میزان جذب در طول موج های بالاتر دیده نمی شود (نمودارهای Aو C). با توجه به شکل ۴-۹ مشخص می شود که آسپیرین در مدت زمان ۳۶ روز در مقایسه با مدت زمان ۲۰ روز باعث القا توده ای شدن پروتئین انسولین می گردد.
شکل ۴-۹- مطالعه ی توده ای شدن انسولین در حضور آسپیرین.
بعد از اتمام زمان انکوباسیون طیف جذبی هر نمونه در محدوده ی طول موج ۲۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر گزارش شد. نمودارهای A، B، C و D به ترتیب مربوط به نمونه انسولین انکوبه شده در عدم حضور آسپیرین به مدت ۲۰ روز، نمونه انسولین انکوبه شده در عدم حضور آسپیرین به مدت ۳۶ روز، نمونه انسولین انکوبه شده با آسپیرین به مدت ۲۰ روز و نمونه انسولین استیله شده با آسپیرین به مدت ۳۶ روز می باشد.
۴-۹- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین در حضور آسپیرین با روش های اسپکتروسکوپی
پژوهش ها نشان می دهد که در فیبر آمیلوئیدی پروتئین ساختارهای مارپیچ آلفا اغلب به صفحات بتا تبدیل می شوند (Bolder و همکاران ۲۰۰۷). بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی انسولین با بهره گرفتن از دستگاه فلورسانس و پروب فلورسانس تیوفلاوین T انجام گرفت. این پروب به ساختارهای بتا متصل می شود و با اتصال آن به این نواحی وقتی در طول موج ۴۴۰ نانومتر تهییج گردد در محدوده ی طول موج های ۴۵۰ تا ۶۰۰ نانومتر نشر خواهد داشت. در این حالت افزایش میزان نشر تیوفلاوین T معرف تشکیل فیبر آمیلوئیدی است (Ritu و همکاران ۲۰۰۵). با توجه به نتایج شکل ۴-۱۰ افزایش شدت نشر فلورسانس تیوفلاوین T نمونه ی انسولین استیله نسبت به انسولین تازه و طبیعی دیده می شود. این افزایش نشر برای نمونه ی انسولین استیله شده با آسپیرین به مدت ۳۶ روز به مراتب بیشتر است. این تغییر محسوس احتمالاً بیانگر وجود فیبرهای آمیلوئیدی در نمونه ی استیله ی ۳۶ روز می باشد. همانطور که در شکل ۴-۱۰ مشخص است میزان نشر فلورسانس تیوفلاوین T نمونه ی انسولین طبیعی انکوبه شده برای ۳۶ روز در مقایسه با نمونه ی ۲۰ روز بالاتر است. به نظر می رسد که علت این پدیده تغییرات ساختاری بیشتر انسولین طی افزایش زمان انکوباسیون باشد به طوری که میزان ساختار های بتا در نمونه ی انسولین طبیعی ضمن انکوباسیون برای مدت زمان طولانی تر افزایش یافته است.
شکل ۴-۱۰- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های انکوبه شده ۲۰ روز (A) و ۳۶ روز (B) انسولین در حضور آسپیرین.
انسولین با غلظت ۲ میلی گرم در میلی لیتر در حضور و عدم حضور ۱۵ میلی مولار آسپیرین در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷ pHو در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. طیف نشری حاصل با برانگیختگی در طول موج ۴۴۰ نانومتر، در محدوده ی ۴۵۰ تا ۶۰۰ نانومتر جمع آوری شد. در این مطالعه غلظت تیوفلاوین T 20 میکرومولار و غلظت انسولین ۱۵/۰ میلی گرم در میلی لیتر بود. حروف F، N، Ac و ThT به ترتیب نشان دهنده ی انسولین تازه تهیه شده، انسولین طبیعی، انسولین استیله و تیوفلاوین T می باشد.
تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین در اثر استیلاسیون با بهره گرفتن از خاصیت اسپکتروسکوپی کنگورد نیز بررسی شد. این رنگ نیز به طور اختصاصی به صفحات بتا متصل می شود و دارای بیشینه ی جذب در طول موج ۴۸۶ نانومتر است. افزایش جذب این پروب همراه با جابجایی بیشینه ی جذب آن به سمت راست (طول موج های بالاتر) معرف تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین می باشد. شکل ۴-۱۱ نشان می دهد که در طیف جذبی کنگورد دو نمونه انسولین که به مدت ۲۰ روز در حضور و عدم حضور آسپیرین انکوبه شدند تغییری مشاهده نمی شود. در مقابل جذب کنگورد برای نمونه ی انسولین استیله شده با آسپیرین برای ۳۶ روز به طور قابل توجهی افزایش یافته است. تغییر مکان طیف جذبی کنگورد به سمت راست برای نمونه ی استیله شده برای ۳۶ روز نشان می دهد که این تغییر شیمیایی در مدت زمان ۳۶ روز تشکیل فیبر آمیلوئید انسولین را به میزان قابل توجهی القا می نماید. نتایج حاصل از هر دو روش اسپکتروسکوپی تشکیل فیبر آمیلوئید هورمون انسولین یکدیگر را تائید می کنند و این پدیده نشانگر وجود فیبر آمیلوئیدی انسولین در حضور آسپیرین طی انکوباسیون ۳۶ روز می باشد.
۵۱۱ nm